Området för bioteknik är en ständig förändring. Den snabba tillväxten och utvecklingen av banbrytande forskning är beroende av innovation och kreativitet forskare och deras förmåga att se potentialen i en grundläggande molekylteknik och tillämpa den på nya processer. Tillkomsten av polymeraskedjereaktion (PCR) öppnade många dörrar inom genetisk forskning, inklusive ett sätt att DNA-analys och identifiering av olika gener baserade på deras DNA-sekvenser. DNA-sekvensering är också beroende av vår förmåga att använda gelelektrofores för att separera DNA-strängar som skiljer sig i storlek med så lite som ett baspar.
DNA-sekvensering
I slutet av 1970-talet uppfanns två DNA-sekvenseringstekniker för längre DNA-molekyler: metoden Sanger (eller dideoxy) och metoden Maxam-Gilbert (kemisk klyvning). Maxam-Gilbert-metoden är baserad på nukleotidspecifik klyvning med kemikalier och används bäst för att sekvensera oligonukleotider (korta nukleotidpolymerer, vanligtvis mindre än 50 baspar i längd). Sanger-metoden används oftare eftersom det har visat sig vara tekniskt lättare att använda och med tillkomsten av PCR och automatisering av tekniken, appliceras lätt på långa DNA-strängar inklusive några hela gener. Denna teknik är baserad på kedjeuppsägning av dideoxynukleotider under PCR-förlängningsreaktioner.
Sanger-metoden
I Sanger-metoden används den DNA-sträng som ska analyseras som en mall och DNA-polymeras används, i en PCR-reaktion, för att generera komplementära strängar med användning av primrar. Fyra olika PCR-reaktionsblandningar framställs, var och en innehåller en viss procentandel av dideoxynukleosidtrifosfat (ddNTP) -analoger till en av de fyra nukleotiderna (ATP, CTP, GTP eller TTP).
Syntesen av den nya DNA-strängen fortsätter tills en av dessa analoger är införlivade, vid vilken tidpunkt strängen är förkortad. Varje PCR-reaktion kommer slutligen att innehålla en blandning av olika längder av DNA-strängar, alla slutar med nukleotiden som var dideoxy märkt för den reaktionen. Gel elektrofores används sedan för att separera strängarna för de fyra reaktionerna, i fyra separata fält, och bestämma sekvensen för den ursprungliga mallen baserat på vilka längder av strängar som slutar med vilken nukleotid.
I den automatiska Sanger-reaktionen används primrar som är märkta med fyra olika färgade fluorescerande taggar. PCR-reaktioner, i närvaro av de olika dideoxynukleotiderna, utförs såsom beskrivits ovan. Därefter kombineras emellertid de fyra reaktionsblandningarna och appliceras på en enda spår av en gel. Färgen på varje fragment detekteras med hjälp av en laserstråle och informationen samlas in av en dator vilket genererar kromatogram som visar toppar för varje färg, från vilken mallen DNA-sekvens kan vara fast besluten.
Typiskt är den automatiserade sekvenseringsmetoden endast exakt för sekvenser upp till maximalt cirka 700-800 baspar i längd. Det är emellertid möjligt att erhålla fullständiga sekvenser av större gener och i själva verket hela genom genom att använda stegvisa metoder såsom Primer Walking och Shotgun-sekvensering.
I Primer Walking sekvenseras en användbar del av en större gen med användning av Sanger-metoden. Nya primrar genereras från ett tillförlitligt segment av sekvensen och används för att fortsätta sekvensbestämma den del av genen som var utanför området för de ursprungliga reaktionerna.
Shotgun-sekvensering innebär att DNA-segmentet av intresse slumpmässigt skärs till mer lämpligt (hanterbara) fragment i storlek, sekvensbestämmer varje fragment och ordnar bitarna baserat på överlappning sekvenser. Denna teknik har underlättats genom tillämpningen av datorprogramvara för att arrangera de överlappande bitarna.