DNA-amplifiering genom polymeraskedjereaktion

PCR står för polymeraskedjereaktion, en molekylärbiologisk teknik för amplifiering av segment av DNA, genom att generera flera kopior med användning av DNA-polymerasenzymer under kontrollerade förhållanden. Så lite som en enda kopia av ett DNA-segment eller gen kan klonas i miljoner kopior, vilket möjliggör detektering med färgämnen och andra visualiseringstekniker.

Utvecklad 1983 har PCR-processen gjort det möjligt att utföra DNA-sekvensering och identifiera ordningen på nukleotider i enskilda gener. Metoden använder termisk cykling eller upprepad uppvärmning och kylning av reaktionen för DNA-smältning och replikering. När PCR fortsätter används det "nya" DNA som en mall för replikering och en kedjereaktion följer, vilket exponentiellt förstärker DNA-mallen.

PCR-tekniker används inom många områden inom bioteknik inklusive proteinteknik, kloning, kriminalteknik (DNA-fingeravtryck), faderskapstest, diagnos av ärftliga och / eller infektionssjukdomar och för analys av miljöprover.

Speciellt inom kriminaltekniker är PCR särskilt användbart eftersom det förstärker även den minsta mängden DNA-bevis. PCR kan också användas för att analysera DNA som är tusentals år gammalt, och dessa tekniker har använts för att identifiera allt från en 800 000 år gammal mammut till mumier från hela världen.

Detta steg är endast nödvändigt för DNA-polymeraser som kräver varmstart PCR. Reaktionen upphettas till mellan 94 och 96 ° C och hålls i 1-9 minuter.

Om proceduren inte kräver initialisering är denaturering det första steget. Reaktionen upphettas till 94-98 ° C under 20-30 sekunder. DNA-mallens vätebindningar störs och enkelsträngade DNA-molekyler skapas.

Reaktionstemperaturen är lägre till mellan 50 och 65 ° C och hålls i 20-40 sekunder. Primrarna härdas till den enkelsträngade DNA-mallen. Temperaturen är extremt viktig under detta steg. Om det är för varmt kanske primern inte binds. Om det är för kallt kan primern binda ofullständigt. En god bindning bildas när primersekvensen stämmer nära med mallsekvensen.

Temperaturen under detta steg varierar beroende på typen av polymeras. DNA-polymeraset syntetiserar en helt ny DNA-sträng.

Detta steg utförs vid 70-74 ° C under 5-15 minuter efter den sista PCR-cykeln.

Detta steg är valfritt. Temperaturen hålls vid 4-15 ° C och avbryter reaktionen.

Under varje cykel fördubblas produkten (den specifika DNA-bit som replikeras).

När DNA-polymeraset tappar aktivitet och konsumerar reagens, saktar reaktionen.

Inga fler produkter samlas.