Hur polymeraskedjereaktion fungerar för att förstärka gener

Polymeraskedjereaktionen (PCR) är en molekylärgenetisk teknik för att göra flera kopior av en gen och är också en del av gensekvenseringsprocessen.

Genkopior görs med hjälp av ett DNA-prov, och tekniken är tillräckligt bra för att göra flera kopior från en enda kopia av genen som finns i provet. PCR-amplifiering av en gen för att göra miljontals kopior, möjliggör detektion och identifiering av gensekvenser med hjälp av visuella tekniker baserade på storlek och laddning (+ eller -) av DNA-biten.

Under kontrollerade förhållanden genereras små segment av DNA av enzymer som kallas DNA-polymeraser, som tillför komplementära deoxinukleotider (dNTP) till en bit av DNA som kallas "mall". Även mindre bitar av DNA, kallade "primers" används som utgångspunkt för polymeras.

Primers är små konstgjorda bitar av DNA (oligomerer), vanligtvis mellan 15 och 30 nukleotider långa. De görs genom att känna till eller gissa korta DNA-sekvenser i ändarna av genen som amplifieras. Under PCR värms DNA: t som sekvenseras upp och dubbelsträngarna separeras. Vid kylning binder primrarna till mallen (kallad annealing) och skapar en plats där polymeraset kan börja.

Polymeraskedjereaktionen (PCR) möjliggjordes genom upptäckten av termofila och termofila polymerasenzymer (enzymer som bibehåller strukturell integritet och funktionalitet efter uppvärmning till hög temperaturer). Stegen som är involverade i PCR-tekniken är följande:

• En blandning skapas med optimerade koncentrationer av DNA-mallen, polymerasenzymet, primers och dNTPs. Förmågan att värma upp blandning utan att denaturera enzymet möjliggör denaturering av den dubbla helixen av DNA-provet vid temperaturer inom intervallet 94 grader Celsius.
• Efter denaturering kyls provet till ett mer måttligt område, runt 54 grader, vilket underlättar hybridiseringen (bindningen) av primrarna till de enkelsträngade DNA-mallarna.
• I det tredje steget av cykeln återupphettas provet till 72 grader, den idealiska temperaturen för Taq DNA-polymeras, för förlängning. Under förlängning använder DNA-polymeras den ursprungliga enkelsträngen av DNA som mall för att lägga till komplementära dNTP: er till 3'-ändarna av varje primer och generera en sektion av dubbelsträngat DNA i regionen för genen av intresse.
• Primers som har hybridiserats till DNA-sekvenser som inte är en exakt matchning förblir inte hybridiserade vid 72 grader, vilket begränsar förlängningen till genen av intresse.

Denna process med denaturering, hybridisering och förlängning upprepas flera (30-40) gånger, vilket ökar exponentiellt antalet kopior av den önskade genen i blandningen. Även om denna process skulle vara ganska tråkig om den utförs manuellt, kan prover förberedas och inkuberas i en programmerbar Thermocycler, numera vanlig i de flesta molekylära laboratorier, och en fullständig PCR-reaktion kan utföras i 3-4 timmar.

Varje denatureringssteg stoppar förlängningsprocessen från den föregående cykeln, vilket trunkerar den nya DNA-strängen och håller den till ungefär storleken på den önskade genen. Varaktigheten av förlängningscykeln kan göras längre eller kortare beroende på storleken på genen av intresse, men så småningom, genom upprepade cykler av PCR, kommer majoriteten av mallarna att vara begränsade till storleken på genen av intresse enbart, eftersom de kommer att ha genererats från produkter från båda primers.

Det finns flera olika faktorer för framgångsrik PCR som kan manipuleras för att förbättra resultaten. Den mest använda metoden för att testa förekomsten av PCR-produkt är agarosgelelektrofores. Som används för att separera DNA-fragment baserat på storlek och laddning. Fragmenten visualiseras sedan med användning av färgämnen eller radioisotoper.

Sedan upptäckten av PCR har andra DNA-polymeraser än den ursprungliga Taq upptäckts. Vissa av dessa har bättre "korrekturläsande" förmåga eller är mer stabila vid högre temperaturer, vilket förbättrar specificiteten för PCR och minskar fel från införandet av felaktig dNTP.

Vissa varianter av PCR har designats för specifika tillämpningar och används nu regelbundet i molekylärgenetiska laboratorier. Några av dessa är Real-Time PCR och Reverse-Transcriptase PCR. Upptäckten av PCR har också lett till utvecklingen av DNA-sekvensering, DNA-fingeravtryck och andra molekylära tekniker.