Endonukleaser för begränsningar är en klass av enzym som skär DNA-molekyler. Varje enzym känner igen unika sekvenser av nukleotider i en DNA-sträng - vanligtvis cirka fyra till sex baspar långa. Sekvenserna är palindromiska i det att den komplementära DNA-strängen har samma sekvens i omvänd riktning. Med andra ord skärs båda DNA-strängarna på samma plats.
Var dessa enzym finns
Restriktionsenzymer finns i många olika bakteriestammar där deras biologiska roll är att delta i cellförsvar. Dessa enzymer begränsar främmande (viralt) DNA som kommer in i cellerna genom att förstöra dem. Värdcellerna har ett restriktionsmodifieringssystem som metylerar sitt eget DNA på platser som är specifika för deras respektive restriktionsenzymer och därmed skyddar dem från klyvning. Mer än 800 kända enzymer har upptäckts som känner igen mer än 100 olika nukleotidsekvenser.
Typer av restriktionsenzymer
Det finns fem olika typer av restriktionsenzymer. Typ I skär DNA på slumpmässiga platser så långt som 1 000 eller fler baspar från igenkänningsstället. Typ III skär på ungefär 25 baspar från platsen. Båda dessa typer kräver ATP och kan vara stora enzymer med flera underenheter. Typ II-enzymer, som övervägande används i bioteknik, skär DNA inom den erkända sekvensen utan behov av ATP och är mindre och enklare.
Typ II-restriktionsenzymer benämns i enlighet med de bakteriearter från vilka de är isolerade. Exempelvis isolerades enzymet EcoRI från E. coli. De flesta av allmänheten känner till E. coli-utbrott i mat.
Typ II-restriktionsenzymer kan generera två olika typer av skärningar beroende på om de skär båda strängar i mitten av igenkänningssekvensen eller varje tråd närmare den ena änden av igenkänningen sekvens.
Det tidigare snittet kommer att generera "trubbiga ändar" utan nukleotidöverhäng. Den senare genererar "klibbiga" eller "sammanhängande" ändar eftersom varje resulterande fragment av DNA har ett överhäng som kompletterar de andra fragmenten. Båda är användbara inom molekylär genetik för framställning rekombinant DNA och proteiner. Denna form av DNA sticker ut eftersom den produceras genom ligering (bindning ihop) av två eller flera olika strängar som inte ursprungligen var länkade ihop.
Typ IV-enzymer känner igen metylerat DNA, och typ V-enzymer använder RNA för att skära sekvenser på invaderande organismer som inte är palindromiska.
Används inom bioteknik
Restriktionsenzymer används i bioteknik för att skära DNA i mindre strängar för att studera skillnader i längd på fragment mellan individer. Detta kallas restriktionsfragmentlängd-polymorfism (RFLP). De används också för genkloning.
RFLP-tekniker har använts för att bestämma att individer eller grupper av individer har distinkta skillnader i gensekvenser och restriktionsklyvningsmönster i vissa områden i genomet. Kunskap om dessa unika områden ligger till grund för DNA-fingeravtryck. Var och en av dessa metoder beror på användningen av agarosgelelektrofores för separering av DNA-fragmenten. TBE-buffert, som består av Tris-bas, borsyra och EDTA, används vanligtvis för agarosgel elektrofores att undersöka DNA-produkter.
Användning vid kloning
Kloning kräver ofta att en gen infogas i en plasmid, som är en typ av en DNA-bit. Restriktionsenzymer kan hjälpa till med processen på grund av de enkelsträngade överhäng som de lämnar när de gör nedskärningar. DNA-ligas, ett separat enzym, kan förena två DNA-molekyler med matchande ändar.
Så, genom att använda restriktionsenzymer med DNA-ligasenzymer, kan bitar av DNA från olika källor användas för att skapa en enda DNA-molekyl.